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作为一种致癌性蛋白酪氨酸磷酸酶，SHP2在癌细胞RTK-RAS-MAPK信号通路中充当交汇节点，通过将信号传递到PD-1下游来抑制抗肿瘤免疫。加科思药业（Jacobio Pharma）研究团队在确认新变构位点可利用的额外口袋后构建了全新的（6,5 fused）, 6螺环骨架，优化后的化合物JAB-3312对SHP2的Kd值为0.37nM、IC50值为1.9nM，在KYSE-520中的抗增殖IC50值为7.4nM，对p-ERK的IC50值为0.23nM。对于JAB-3312，口服1.0mg/kg QD足以在KYSE-520异种移植小鼠模型中达到95%的TGI。JAB-3312在动物模型中耐受性良好，在肿瘤中观察到JAB-3312血浆浓度与p-ERK抑制密切相关。目前，JAB-3312正作为一种潜在的抗癌药物进行临床试验。药渡CyberSAR系统提供了对SHP2变构抑制剂分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在本案例分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。
PTPN11基因编码的SHP2是一种非受体磷酸酶，由两个N端SH2结构域（N-SH2和C-SH2）、中央蛋白PTP结构域和C端富含脯氨酸的磷酸化酪氨酸尾组成。在肿瘤细胞中，SHP2在RTK-RAS-MAPK通路中起着关键节点的作用，将细胞外的刺激信号传递给癌基因。SHP2被RTK激活后会招募GRB2-SOS以促进KRAS的GTP交换，并使包括RAS在内的各种蛋白质去磷酸化，以确保激活信号从RTK到ERK的有效传递。由于SHP2在RTK-RAS-MAPK通路中起着交汇节点的作用，因此使用RTK或KRAS抑制剂同时抑制SHP2和该通路中的其他靶点是完全抑制癌症中RTK-RAS-MAPK信号转导的可行方法。在T淋巴细胞中，PD-L1与PD-1结合后招募SHP2，SHP2使一组靶标去磷酸化，从而抑制基于TCR的T细胞激活。因此，开发一种安全有效且耐受性良好的SHP2抑制剂作为单药或联合疗法对于癌症治疗非常重要。早期SHP2抑制剂的研究表明，由于PTP（蛋白酪氨酸磷酸酶）结构域之间的高度序列同源性和活性位点的静电特性，从正交PTP结构域开发具有足够靶向特异性和细胞渗透性药物的可能性很小。诺华公司通过高通量筛选和生化及共结晶研究，已确定了两个变构结合口袋：隧道位点和卡扣位点。在N-SH2和PTP结构域之间的裂缝形成的“卡扣”样位点中，即使是经过优化的化合物对SHP2的IC50也有数十微摩尔，且几乎不能稳定SHP2。因此，卡扣位点可能不是高效SHP2抑制剂的理想口袋。隧道位点主要由C-SH2和PTP结构域之间的界面形成，诺华公司基于氨基吡嗪骨架开发了SHP099，SHP099对SHP2的IC50值为71nM，在体外可抑制RTK依赖性癌细胞系的生长，并可抑制小鼠KYSE-520异种移植瘤模型中的肿瘤生长，同时降低肿瘤内磷酸化ERK（p-ERK）水平。此外，在结肠癌异种移植瘤模型中，还可观察到SHP099治疗后致敏性CD8 T细胞数量的增加。基于SHP099，一种更安全有效的Batoprotafib（TNO155）被开发并进入临床研究。除了TNO155外，目前还有几款SHP2抑制剂，如RMC- 4630、GDC-1971、BBP-398、ARRY-558、ET0038、ERAS601等SHP2抑制剂目前正在进行临床试验。本研究在保留SHP099原始骨架的同时对变构隧道口袋之外的化学空间进行了探索，通过基于活性、hERG抑制作用和细胞渗透性的连续优化，发现了高效SHP2结合抑制剂JAB-3312。JAB-3312在小鼠异种移植模型中抑制了SHP2依赖性肿瘤细胞（KYSE-520）的生长，口服剂量为1.0mg/kg QD时即可实现95%的肿瘤生长抑制（TGI）。在药代动力学研究中，JAB-3312口服生物利用度良好，且在肿瘤中显示出明显的药物相关p-ERK抑制作用。目前，JAB-3312正在进行临床抗癌试验。
诺华公司报道的变构隧道位点抑制剂SHP099的体内活性一般，其原因可能是化合物与SHP2配位不足而影响了其对SHP2的抑制活性（IC50=71nM），这在SPR结合分析中得到了验证。为了在变构隧道位点周围开发更有效的SHP2抑制剂，本研究首先对靶点口袋进行了分析。结果显示，与SHP099结合的变构隧道位点仅是口袋的一部分，而SHP099甲基基团所指向的另一部分可以容纳306.2Å3的体积。因此，本研究拟利用这个未占用的体积来开发更有效的SHP2抑制剂。相关研究表明，引入将氨基吡嗪和吡啶通过硫醚连接的改良骨架可以提高化合物活性，哌啶上带有芳基的化合物表现出与含有改良骨架化合物相当的SHP2抑制作用。据此，本研究首先将苯基或噻吩与哌啶上的甲基相连，所得化合物2和3的SHP2 IC50值分别为16和18nM，SPR Kd值分别为3.7和5.8nM，与参考化合物N-33相当，表明C-SH2和PTP结构域之间的未占用空间可由额外的化学基团填充。
为提高对SHP2的抑制活性，对2进行螺环化得到4，其对SHP2的IC50值为3.7nM，SPR Kd为1.3nM。切换苯基连接位置得到5，其SHP2 IC50值无明显差异，但SPR Kd值是4的8倍左右，说明5中的苯基可能无法被SHP2正确配位。将螺环戊烷扩展为螺环己烷得到6和7，其SHP2 IC50和SPR Kd均不甚理想。此外，在KYSE-520细胞中，4较其他三个化合物具有更强的抗增殖作用。
然而，4对离子通道hERG的IC50值为1.5μM，表明其可能存在心血管风险，这可能与苯基的引入导致亲脂性增加相关。对苯基进行亲水或疏水性基团取代发现，含有亲水性基团的化合物（8、9、10、13、14）的ClogP显著降低，其对hERG的抑制作用也相应减轻；含有疏水性基团的化合物（15）的ClogP升高，对hERG抑制作用增强。然而，化合物8、9、10、13、14的酶抑制作用和抗增殖活性均出现了降低，且抗增殖活性的降低程度比对SHP2抑制活性的减弱程度更为明显，这与亲水基团的引入导致化合物无法有效地穿透细胞膜有关。上述结果表明，在4的苯基上引入亲水性基团无法解决其hERG问题。
将苯基替换为五元环得到化合物16、17和18，其中18对hERG的抑制作用明显减弱，而SHP2 IC50、SPR Kd和抗增殖IC50值与4相当。在KYSE-520细胞中，18的p-ERK IC50值为0.44nM，与4相当。Caco-2细胞渗透性试验显示，18表现出中等的外排比（ER=4.4）。此外，SD大鼠体内的药代动力学数据显示，18表现出良好的口服生物利用度和药物暴露。但因18在异种移植研究中观察到了毒性问题，并未对18进行进一步的优化。将苯基替换为吡啶得到化合物19、20、21和22，其中22对hERG的抑制作用较弱，对p-ERK的抑制活性增强，且SHP2 IC50、SPR Kd和抗增殖IC50值与4相当。但22的Caco-2 ERs为7.5，可能存在体内吸收问题，因此继续对其进行优化，以解决高Caco-2 ER问题。
22与SHP2的共晶结构显示，共晶中的SHP2蛋白采用了常见的闭合构象，除（6,5 fused）, 6螺环上的吡啶外，22的共晶结构与SHP2-TNO155配合物相似，具有一组TNO155典型的相互作用：Arg111与2-氨基-3-氯吡啶和吡嗪N原子形成阳离子-π和氢键；Thr108、Glu110、Phe113螺氨基戊烷的伯胺形成氢键/极性接触；Th r253、Leu254、Gln257、Pro 491和Gln495构成了疏水口袋。与TNO15 5不同的是，22的螺氨基戊烷中的伯胺和Thr253都发生了微小的移动，进而形成了氢键。22中的吡啶结构建立了两个π堆积作用：与Glu249和Phe113一起形成阴离子(Glu249)-π(吡啶) -π(Phe113)相互作用，其中吡啶以边对面（T形）方式堆叠在Phe113上，吡啶N作为受体与水分子形成氢键，加强了阴离子-π-π堆积；与His114的羰基堆积形成羰基-π相互作用。这种22吡啶与Phe113的π-π堆积、氢键和吸电子效应都稳定了阴离子-π堆积。实验表明，22较4的SHP2解离速度更慢、结合亲和力更高，其阴离子-π-π/羰基-π和阳离子-π堆积可被视为针对SHP2结合优化的SHP2封闭构象稳定剂。可被视为针对SHP2结合优化的SHP2封闭构象稳定剂。为了保持22中有利的堆叠相互作用，保留了22（6,5 fused）, 6螺环骨架上吡啶，以进行进一步的优化。
在R1位置进行甲基取代或胺基去除得到23、24和25。虽然23和24的SHP2 IC50、SPR Kd和抗增殖IC50与22相当，但Caco-2 ERs没有明显降低。虽然25的Caco-2 ER显著降低，但其SPR Kd和抗增殖IC50劣于22。此外，23、24和25的hERG窗口比22的缩小了大约7-14倍。删除R2伯胺后，化合物1（JAB-3312）的Caco-2 ER为0.8，比22降低约10倍。JAB-3312的SHP2 IC50为1.9nM，SPR Kd为0.37nM、抗增殖IC50为7.4nM。虽然JAB-3312由于R2胺的缺失而丢失了与Glu250的氢键，但其SPR Kd与22相当。在配体亲脂性效率（LLE）方面，JAB-3312（LLE=6.8）与TNO155（LLE=5.7，pIC50=8.0）相似，处于一个平衡抑制效力和配体疏水性的有利范围内（LLE，5-7）。JAB-3312的hERG IC50为4.4μM，与经验毒性阈值（10μM）和22（hERG IC50=8.2μM）略有偏离，但其hERG窗口（592）与22（500）相当。此外，使用比格犬对JAB-3312进行心电图研究发现，在有效肿瘤抑制所需药物暴露量3倍的情况下未检测到包括Qt间期在内的心电图指标异常，表明其心血管风险较低。使用SD大鼠对JAB-3312、4和22进行药代动力学研究发现，JAB-3312具有最高的Cmax/AUC，最慢的药物清除率（CL）和良好的表观分布容积（Vss）。其中，Caco-2参数（PA-B>10×10-6cm/s，ER<1）表明，JAB-3312的药代动力学参数增强可能是由于其吸收改善所致。脱靶活性分析发现，JAB-3312在10μM时对其他22种磷酸酶（包括SHP1和SHP2的PTP结构域）和25种激酶没有抑制作用。JAB-3312在磷酸盐缓冲液（pH 6.8，37°C）中的溶解度为104.6μM，pKa为3.1、4.6和7.5。总之，JAB-3312是一种高效选择性SHP2抑制剂，具有良好的细胞渗透性/药物吸收、hERG抑制作用和药物暴露，值得进一步的体内研究。
在所有物种（SD大鼠、比格犬、食蟹猴）中，JAB-3312均表现出快速的口服吸收（Tmax<2h），在大鼠、狗、猴中的生物利用度（F）分别为52.2、86.8和56.7%。JAB-3312消除缓慢，血浆清除率低（大鼠、狗、猴的CL分别为4.7、2.5和1.9mL/min/kg）。JAB-3312在比格犬血浆中的保留时间（t1/2=27.0h）长于其他两种动物（大鼠和猴的t1/2分别为4.7和7.4h）。JAB-3312在5个物种（人/猴/狗/大鼠/小鼠）中的血浆蛋白结合率分别为98.2%、96.8%、94.0%、98.5%和95.0%。
对于两种异种移植模型（KYSE-520和MV-4-11），JAB-3312均表现出剂量依赖性抗肿瘤作用，每日0.1mg/kg（QD）剂量下足以达到>50% TGI（p<0.01），特别是KYSE-520异种移植物TGI达到了95%。在MV-4-11异种移植物中，0.5mg/kg（QD）JAB-3312的抗肿瘤作用弱于SHP099（50mg/kg，QD），可能需要更高的剂量才能在MV-4-11异种移植物中实现更强的抗肿瘤效果。JAB-3312的给药耐受性良好，在整个治疗过程中没有体重减轻迹象。
JAB-3312的药代动力学性质与p-ERK抑制作用在肿瘤中的关系分析
对KYSE-520模型进行单剂量（0.1、0.3和1.0mg/kg）口服JAB-3312发现，血浆和肿瘤中的JAB-3312水平随着剂量的增加而升高，。在0.1mg/kg组中，JAB-3312仅在4h时在肿瘤中检测到。JAB-3312分别在0.5h和4h达到血浆和肿瘤中的最大浓度。JAB-3312对p-ERK的抑制程度与其在肿瘤中的剂量和浓度成正比，p-ERK抑制峰值（4h）与JAB-3312浓度峰值同步，表明JAB-3312药代动力学与其体内p-ERK抑制等生物活性存在密切相关性。分析JAB-3312对p-ERK的抑制作用与血浆浓度的关系发现，JAB-3312抑制p-ERK的EC50值为19.6nM，EC90值为276nM。即使在0.1mg/kg的浓度下，血浆未结合的JAB-3312浓度也高于细胞p-ERK IC50。估计JAB-3312在人体研究的有效剂量为4.5-8mg QD。
人肝微粒体CYP测定结果显示，JAB-3312对7种主要CYP亚型（1A2/2B6/2C8/2C9/2C19/2D6/3A4）均无明显抑制作用。JAB-3312在培养的人原代肝细胞中未上调CYP（1A2/2B6/3A4）mRNA转录，表明CYP诱导的可能性较低。在人肝微粒体中，JAB-3312对其代谢酶CYP3A4没有时间依赖性抑制作用。JAB-3312不作为各种药物转运蛋白（BCRP、MDR1、OATP1B1、OATP1B3、OCT2、OAT1和OAT3）的底物，也不能对其有效抑制。上述结果表明，JAB-3312体内药物相互作用的风险较低。
本研究通过对含有苯基结构的化合物2进行螺旋环化（4），得到了（6,5 fused）, 6螺环骨架。基于该骨架，通过将苯基替换为吡啶（22），解决了在4的hERG抑制问题。22的共晶结构显示（6,5 fused）, 6螺环骨架参与了阴离子-π-π和羰基-π的堆积，2-氨基-3-氯吡啶参与了阳离子-π的堆积，这两侧的堆叠相互作用使22成为优良的SHP2结合抑制剂。为了解决22的药物吸收问题，去除吡嗪上的伯胺得到了JAB-3312。JAB-3312是一种选择性SHP2抑制剂，能有效抑制KYSE-520细胞增殖（IC50=7.4nM）。JAB-3312在口服1.0mg/kg QD剂量下足以在KYSE-520异种移植小鼠模型中达到95%的TGI。此外，在NCI-H1373小鼠异种移植模型中，JAB-3312和Glecirasib具有协同抗肿瘤作用。在动物模型中，JAB-3312耐受性良好，并表现出良好的药代动力学特征。此外，JAB-3312的p-ERK抑制与肿瘤内药物浓度密切相关。虽然JAB-3312存在一定的hERG抑制作用（hERG IC50=4.4μM），但在动物研究中，没有观察到JAB-3312所导致包括Qt间期在内的任何心电图指标异常。并且，JAB-3312的hERG IC50/Cmax-未结合比率超过1000。一项使用Glecirasib和JAB-3312联合治疗的临床试验显示，没有药物相关的心血管异常。说明JAB-3312心血管风险较低。目前，JAB-3312正在作为单一和联合疗法进行临床研究。10.1021/acs.jmedchem.4c00360
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